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方案概述

前言：

亞硝胺雜質(zhì)是一類具有亞硝基與胺結(jié)合（R1N(-R2)-N=O）的化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，具有高潛在致突變致癌性。自華海纈沙坦事件以來，多種藥品中相繼檢出小分子亞硝胺類雜質(zhì)（如NDMA、NDEA、NDBA等）或與原料藥相關(guān)的亞硝胺類雜質(zhì)（NDSRI），使得監(jiān)管機(jī)構(gòu)和制藥企業(yè)對該類雜質(zhì)一直高度關(guān)注。

NDSRI(Nitrosamine drug substance-related impurities)是一類與原料藥有著類似結(jié)構(gòu)單元的亞硝胺類雜質(zhì)，它可通過含仲胺或叔胺結(jié)構(gòu)的原料藥(或原料藥片段)亞硝化形成。NDSRI雜質(zhì)是每種原料藥特有的雜質(zhì)，通常因缺乏致癌性和致突變性研究數(shù)據(jù)，確定其在藥品中的可接受水平極具挑戰(zhàn)。2023年8月4日，F(xiàn)DA發(fā)布了亞硝胺原料藥相關(guān)雜質(zhì)推薦可接受攝入量（AI）限度值的控制指南，該指南根據(jù)預(yù)測的致癌效力分類為NDSRI雜質(zhì)AI值提供了建議，同時相關(guān)的指南文件也一直在持續(xù)更新。

地氯雷他定（Desloratadine），又稱AERIUS (先靈葆雅)/DENOSIN (美時)，屬于三環(huán)長效型的第三代組織胺拮抗劑(Antagonist)，選擇性作用在H1接受體，其化學(xué)名為8-氯-6, 11-二氫-11-(4-亞哌啶基)-5H-苯并[5, 6]庚烷[1, 2b]吡啶，分子式為C₁₉H₁₉N₂Cl。一般用于緩解慢性特發(fā)性蕁麻疹及常年過敏性鼻炎的全身及局部癥狀。地氯雷他定因結(jié)構(gòu)中含有仲胺，可能會產(chǎn)生相應(yīng)的NDSRI雜質(zhì)，推測其亞硝基雜質(zhì)結(jié)構(gòu)如下圖1，根據(jù)FDA發(fā)布的亞硝胺原料藥相關(guān)雜質(zhì)推薦可接受攝入量控制指南中記載N-亞硝基-地氯雷他定AI（允許攝入量，Acceptable Intake）值均為400ng/天。

圖1 地氯雷他定及其N-亞硝基-地氯雷他定結(jié)構(gòu)圖

亞硝胺雜質(zhì)AI值為400ng/天，結(jié)合地氯雷他定口服溶液已批準(zhǔn)說明書規(guī)定的最大日劑量5mg/天計算，控制限度為80ppm。結(jié)合限度，開發(fā)了高效液相色譜法對地氯雷他定原料中的亞硝胺雜質(zhì)進(jìn)行測定，并且對方法采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3400系列配置紫外檢測器進(jìn)行相應(yīng)的方法學(xué)驗證，包括：專屬性、線性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、檢測限等，結(jié)果顯示該方法專屬、靈敏。

關(guān)鍵詞：地氯雷他定、高效液相色譜法、NDSRI雜質(zhì)。

1.儀器設(shè)備及試劑

1.1液相配置清單

表1 高效液相色譜系統(tǒng)配置清單

序號	名稱	數(shù)量
1	LC3400系列高效液相色譜儀	1臺
2	P3400B 二元高壓恒流泵	1臺
3	CT3400 柱溫箱	1臺
4	AS3400 全自動進(jìn)樣器	1臺
5	SmartLab NetCDS 色譜使用工作站	1套
6	C18 250x4.6 mm，5 μm	1個

1.2試劑及標(biāo)準(zhǔn)品清單

表2 試劑及標(biāo)品清單表

序列	試劑及標(biāo)準(zhǔn)品	純度
1	乙腈	HPLC級
2	三氟乙酸	AR級
3	十二烷基硫酸鈉	AR級
4	N-亞硝基-地氯雷他定	98.9%

1.3實驗材料及輔助設(shè)備

超聲波清洗機(jī)；

渦旋混合器。

2.實驗方法

2.1 溶液配制

2.1.1 十二烷基硫酸鈉水溶液:取0.865g十二烷基硫酸鈉，三氟乙酸0.5mL，加水稀釋至溶解在1000mL。

2.1.2 溶劑:同流動相（精密量取十二烷基硫酸鈉水溶液570mL和乙腈430mL，混勻，即得。

2.1.3 線性溶液:取N-亞硝基-地氯雷他定對照品各適量，精密稱定加流動相溶解并稀釋至每1mL約含0.8μg的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液母液；然后精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.0mL、1.5mL、2.0mL、4.0mL、10.0mL分別置于5個100mL容量瓶中，加流動相定容至刻度線，搖勻，配制成濃度為8ng/mL、12ng/mL、16ng/mL、32ng/mL和80ng/mL標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線。

2.1.4 對照品溶液:取N-亞硝基-地氯雷他定對照品各適量，精密稱定，用流動相溶解并稀釋制成每1mL約含N-亞硝基-地氯雷他定16ng的溶液，作為對照品溶液。

2.2 樣品配制

2.2.1 樣品溶液

精密移取地氯雷他定原料滴劑適量，用流動相溶解并稀釋制成每1mL約含地氯雷他定0.2mg的溶液，作為樣品溶液。

2.2.2 準(zhǔn)確度溶液

準(zhǔn)確度樣品配制：取地氯雷他定原料約20mg，精密稱定至100mL量瓶中，加入適量的N-亞硝基-地氯雷他定對照品溶液，用流動相溶解并稀釋至刻度，配制成100%加標(biāo)樣品，搖勻，即得，作為準(zhǔn)確度溶液。

3.實驗結(jié)果

3.1 專屬性

圖2 專屬性測試譜圖

說明：溶劑不干擾N-亞硝基-地氯雷他定檢測，供試品溶液中其他雜質(zhì)色譜峰亦不干擾N-亞硝基-地氯雷他定雜質(zhì)測定。

3.2 線性測試

圖3 N-亞硝基-地氯雷他定雜質(zhì)測試色譜疊加圖

圖4 N-亞硝基-地氯雷他定雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

說明：實驗結(jié)果顯示，N-亞硝基-地氯雷他定雜質(zhì)測試曲線相關(guān)系數(shù)R值在0.999以上，滿足試驗要求。

3.3 重復(fù)性測試

圖5 6針16ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)性測試譜圖

表3 6針16ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)性測試數(shù)據(jù)

化合物名	保留時間（min）	峰面積(mAU*s)
N-亞硝基-地氯雷他定	15.426	2.917
	15.432	2.864
	15.414	2.838
	15.416	2.994
	15.423	2.856
	15.417	2.937
平均值	15.421	2.901
RSD（%）	0.045	2.043

說明：由上表數(shù)據(jù)可知，N-亞硝基-地氯雷他定保留時間重復(fù)性為0.045%；峰面積重復(fù)性為2.043%，重復(fù)性良好。

3.4 準(zhǔn)確度測試

圖6 地氯雷他定原料準(zhǔn)確度疊加圖

表4 地氯雷他定原料準(zhǔn)確度（N-亞硝基-地氯雷他定）

水平	已有量（ng）	加入量（ng）	測得量（ng）	回收率（%）	平均值（%）	RSD（%）
100%	0.00	1611.52	1656.365	99.690	100.11	2.58
100%	0.00		1610.546	96.932
100%	0.00		1686.721	101.517
100%	0.00		1704.476	102.585
100%	0.00		1615.701	97.242
100%	0.00		1706.194	102.689

說明：6份樣品中N_-亞硝基-地氯雷他定的回收率在97.24~102.69%，RSD為2.58%，本方法檢測準(zhǔn)確度及重復(fù)性良好。

3.5 檢測限測試

圖7 N-亞硝基-地氯雷他定濃度為8ng/mL對照品測試譜圖

表5 N-亞硝基-地氯雷他定濃度為8ng/mL對照品測試數(shù)據(jù)

名稱	保留時間(min)	峰面積(mAU*s)	信噪比
N-亞硝基-地氯雷他定	15.434	1.213	30.042

說明：根據(jù)上表N-亞硝基-地氯雷他定濃度為8ng/mL對照品測測試數(shù)據(jù)，3倍信噪比為檢測限計算可知N-亞硝基-地氯雷他定檢測限理論結(jié)果分別為0.7989ng/mL。

3.6 某廠家原料測試

圖8 某廠家原料和口服溶液測試譜圖

說明：某品牌原料中未檢測出N-亞硝基-地氯雷他定。

4.結(jié)論

根據(jù)FDA日前發(fā)布的藥物基質(zhì)亞硝胺雜質(zhì)（NDSRI，Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities）允許攝入量設(shè)定的指南文件對地氯雷他定原料中亞硝胺雜質(zhì)N-亞硝基-地氯雷他定進(jìn)行研究。根據(jù)該文件計算AI（允許攝入量，Acceptable Intake）值均為400ng/天，同時結(jié)合本品最大日劑量（5mg），在原料中的控制限度均為不得過80ppm。采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3400系列配置紫外檢測器進(jìn)行相應(yīng)的方法學(xué)驗證,用已驗證的檢測方法對原料樣品進(jìn)行檢測未檢出亞硝胺雜質(zhì)N-亞硝基-地氯雷他定。以上數(shù)據(jù)均滿足藥典方法對于儀器的要求。

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